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無細胞蛋白質アレイを基盤とした細胞がん化Ｅ３リガーゼの網羅的同定と解析

研究代表者
澤崎達也
愛媛大学・無細胞生命科学工学研究センター
http://www.ehime-u.ac.jp/~cellfree/sawasakilab/

【研究概要】

タンパク質修飾の1つであるユビキチン化は、分解の“目印”以外にも、タンパク質の活性化や局在制御などに関与する新たなタンパク質機能制御機構であり、細胞のがん化への関与が指摘されています。特異的なE3リガーゼが基質タンパク質と結合することにより、ユビキチン化が進行するため、細胞がん化に関与するユビキチン依存的なシグナル伝達系を解明するためには、細胞がん化に関与する、がん抑制タンパク質やがん化促進タンパク質と結合するE3リガーゼを同定する必要があります。

ヒトゲノム上には、数百種類以上のE3リガーゼ遺伝子が存在することや、細胞抽出液中のプロテアソームによる分解が素早いため、特異的E3リガーゼを同定することはほとんど不可能であるのが現状です。そのため、目的のタンパク質を特異的にユビキチン化するE3リガーゼを同定できる技術が待ち望まれています。

私達は、これまでにプロテインアレイ作製に必要なタンパク質合成技術の開発を進めてきました。その結果、世界に先駆けて、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成技術と、ハイスループットなタンパク質合成技術の開発に成功し、また最近、コムギ胚芽抽出液中にはプロテオリポソームが含まれないことを利用し、高感度にかつハイスループットにモノユビキチン化とポリユビキチン化をそれぞれ別に検出可能なin vitroユビキチン化アッセイ（アルファスクリーン法）を確立し、152種類のRING-typeE3リガーゼプロテインアレイを用いて、強力ながん抑制因子であるp53とLKB1と結合およびin vitroでユビキチン化を行う新規E3リガーゼ分子の同定に成功しています。

本研究では、合計350種類のRING-type E3リガーゼのプロテインアレイ化と、p53、LKB1を含め、他のがん抑制因子およびRasなどのがん促進因子を対象にスクリーニングを行い、細胞がん化を促進する新しいE3リガーゼ分子の探索とE3リガーゼにより惹起されるタンパク質修飾シグナル伝達経路の分子メカニズムの解明を目指します。同時に、本研究を通じて、E3リガーゼの基質同定に最適化したプロテインアレイの技術開発を行います。

【参考文献】

  1. Akagi T, Shimizu K, Takahama S, Iwasaki T, Sakamaki K, Endo Y, Sawasaki T. Caspase-8 cleavage of the interleukin-21 (IL-21) receptor is a negative feedback regulator of IL-21 signaling. FEBS Lett. 585, 1835-1840 (2011)
  2. Tadokoro D, Takahama S, Shimizu K, Hayashi S, Endo Y, Sawasaki T. Characterization of a caspase-3-substrate kinome using an N- and C-terminally tagged protein kinase library produced by a cell-free system. Cell Death Dis. 1, e89 (2010)
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